3.4 INDEL检测与注释

          流程结果
          ├── 04.INDEL (进入文件目录)
          │     ├── Sample1                                  
          │     │   ├── 表3.4.5_INDEL密度统计_Sample1.csv (因数据过多，未列入报告)
          │     │   ├── 图3.4.1_样本INDEL效应类型占比_Sample1.png                  
          │     │   ├── 图3.4.2_样本INDEL发生位点占比_Sample1.png                   
          │     │   └── 图3.4.4_样本INDEL密度热力图_Sample1.png                  
          │     ├── ...
          │     ├── 表3.4.2_INDEL变异信息统计（按对基因的影响预测统计）.csv
          │     ├── 表3.4.3_INDEL变异信息统计（按区域统计）.csv
          │     ├── 表3.4.4_INDEL长度统计.csv
          │     └── 图3.4.3_样本INDEL长度分布.png
          └── ...            
        

INDEL变异指的是插入/缺失变异（Insertion and Deletion variation）， 即基因组上由一个或多个核苷酸的插入或缺失造成的遗传变异。 由于Freebayes所使用的算法在复杂区域也具有较高的灵敏性与容错率， 所以其在检测SNP位点的同时也可以检测出小片段（不超过50bp）的插入/缺失变异。

INDEL分析中，Freebayes使用的参数与SNP检测相同，过滤参数相同。 下面将针对这一算法在识别SNP与INDEL的步骤差异进行解释:

• 寻找候选变异时，若该区域存在大量错配或低质量比对时，Freebayes会将其标记为INDEL候选位点。
• 变异校验时，由于INDEL涉及连续的碱基变异会使得计算概率空间变得更加复杂， 所以Freebayes会对INDEL候选变异进行局部重比对，以更准确地确定INDEL的位置和类型。 同时，Freebayes会向候选位点左右两侧延伸比对的长度，以确定INDEL的精确边界。
• 输出结果时：由于INDEL可能导致测序读取在不同位置产生相似的比对， Freebayes会进行多重比对以评估最有可能产生的情况。

以下为结果文件示例

以下为注释信息统计。表格右上角的检索框可用于筛选包含检索内容的条目，即仅显示包含输入关键词的行

3.5 SV检测与注释

          流程结果
          ├── 05.SV (进入文件目录)
          │     ├── Sample1                                  
          │     │   ├── 表3.5.5_SV长度统计_Sample1.csv  (因数据过多，未列入报告)
          │     │   ├── 图3.5.1_样本SV效应类型占比_Sample1.png                  
          │     │   └── 图3.5.2_样本SV发生位点占比_Sample1.png                                   
          │     ├── ...
          │     ├── 表3.5.2_SV变异信息统计（按对基因的影响预测统计）.csv
          │     ├── 表3.5.3_SV变异信息统计（按区域统计）.csv
          │     ├── 表3.5.4_SV变异类型统计.csv
          │     ├── 图3.5.3_样本SV类型堆叠图.png
          │     └── 图3.5.4_样本SV长度分布箱线图.png
          └── ...             
        

SV（Structural Variants）指的是染色体结构上变异，包括插入（Insertion）、删除(Deletion)、倒位(Inversion)、易位(Translocation)等。它们在基因组中占据较大的区域，与一些疾病的发生、遗传差异及进化等都有关联。 由于算法限制，对SNP进行检测的算法对50bp以上的插入缺失事件的检测精度不高，且无法检测倒位等大规模事件。 为了更全面地检测变异，本次分析采用Delly软件^[5]对所有样本的比对数据(bam)进行结构变异检测。 检测到的SV结果经过过滤后进行注释，以确保结果的准确性和可靠性。

Delly的算法与参数介绍如下：

1. Delly是一种配对末端测序数据（Paired-End reads）和分割序列（Split reads）的结构变异检测软件。分割序列指的是序列中有部分碱基没有连续比对至参考基因组上的序列，这通常是由某种结构性变异产生。 在这种情况下，比对算法会将这些没能比对的碱基标记为软裁剪（soft-clipped）以确保一段序列中的多数碱基被成功比对。通过结合前者所提供的序列方向与预期距离，与后者提供的断点（Breakend）位置， Delly可以精确定位结构性变异的发生位置，从而提供更全面的变异信息。
• 该算法的计算步骤如下：
• 提取异常配对信息：根据测序序列对的预期距离（来源于制备时文库片段长度）和预期方向性，识别比对至参考基因组后发生异常的读取对。如序列对分别比对至不同的染色体上，这也被视作异常。
• 定义潜在结构变异区域：基于每一种结构性变异在比对时具有的特性定义结构性变异的潜在发生区域。
• 分割序列定位：在定义的潜在区域中寻找分割序列，并利用分割序列两端的断点初步定位结构变异的发生位置。
• 局部重比对: 基于分割序列产生k-mer短序列，再与参考基因组进行局部重比对。局部重比对后，根据证据reads建立共识序列（consensus sequence）。 共识序列在此处指的是由重合区域出现频率最高的碱基连接而成的一短序列。
• 最终比对: 使用动态双重规划，将共识序列与潜在结构变异区域进行对齐，并在正反链方向上计算评分矩阵以定义最优左右断点。
• 结果输出：将SV输出至vcf文件，其中每个变异的质量评分和其它相关信息都会被记录。
• Delly的运行参数解释如下：
• map-qual: 参与SV检测的reads所应具有的最低比对质量。（默认为1，当前为1）
• qual-tra: 作为移位证据的reads所应具有的最低质量分数（默认为20，当前为20）
• mad-cutoff: 过滤插入大小异常的reads时采取的最大中位绝对偏差(MAD)（默认为9，当前为9）
• minclip: 计入split-read时，reads中的soft-clipped长度下限（默认为25，当前为25）
• min-clique-size: 成为SV支持证据的最小reads配对数量（默认为2，当前为2）
• minrefsep: split-reads在参考基因组上的最小分离距离（默认为25，当前为25）。
• maxreadsep: 计入同一个SV的两个split-reads之间的最大分离距离（默认为40，当前为40）。

在检测完成后，需要对变异位点进行过滤，以保证结果的可信度。本次分析中变异位点的过滤规则如下：

• 保留QUAL分数大于20的位点（推荐值为：30）
• 保留PE > 3的位点（推荐值为：3）
• PE表示为SV预测提供支持的配对末端（Paired Ends）数量
• 保留SR > 0的位点（推荐值为：0）
• SR表示为SV预测提供支持的分割序列（Split reads）数量
• 保留SRQ > 0的位点（推荐值为：0）
• SR表示为SV预测提供支持的分割序列（Split reads）的比对质量

以下为结果文件示例

以下为注释信息统计。表格右上角的检索框可用于筛选包含检索内容的条目，即仅显示包含输入关键词的行

3.6 CNV检测与注释

              流程结果
              ├── 06.CNV (进入文件目录)
              │     ├── Sample1                                  
              │     │   ├── 表3.6.4_CNV长度统计_Sample1.csv (因数据过多，未列入报告)
              │     │   ├── 图3.6.2_样本CNV效应类型占比_Sample1.png                 
              │     │   └── 图3.6.3_样本CNV发生位点占比_Sample1.png                                
              │     ├── ...
              │     ├── 表3.6.2_CNV变异信息统计（按对基因的影响预测统计）.csv
              │     ├── 表3.6.3_CNV变异信息统计（按区域统计）.csv
              │     └── 图3.6.4_样本CNV长度分布箱线图.png
              └── ...                 
            

CNV（Copy Number Variants）指的是DNA片段在基因组中的拷贝数上发生的变异。这个片段的长度不一，可以覆盖一个基因乃至上兆的碱基。 虽然检测结构性变异的工具通常也能用来检测拷贝数变异，但由于拷贝数变异的特殊性质（如成片段加倍），使得它们在检测CNV上的精确性不如专门被设计于CNV检测的工具。 为了更准确地分析拷贝数变异，本次分析采用了CNVnator^[6]（参数：窗口大小 10000bp）对所有样本的比对数据进行变异检测。 得到的CNV结果经过后处理和过滤，以确保结果的准确性和可靠性。

CNVnator的流程介绍如下：

1. CNVnator是基于测序深度（Read Depth）检测拷贝数变异（CNVs）的工具
2. 该算法的计算步骤如下：
• 基因组分窗：参考基因组将首先按固定大小分割为非重叠的窗口（Bin）。窗口的大小被称作分辨率，影响检测拷贝数变异的精度。
• 读取深度数据：将比对数据（BAM文件）排列至每个窗口上，进而计算每个窗口的测序深度。此处假设测序深度与该窗口的拷贝数成正比。
• 深度数据标准化：对每个窗口的测序深度进行标准化，以减少GC含量与平台误差等因素对测序获得的深度的影响。
• 识别测序深度的变化信号：计算全基因组或特定染色体上所有窗口的平均测序深度及其方差，并评估每个窗口的测序深度是否显著偏离均值。若是，则表明该窗口可能存在拷贝数变异。
• 分段合并：获得全局异常测序深度的信号后，相邻且测序深度信号相似的窗口将被合并为单一的拷贝数变异区域，并依据这一信号判断变异类型。

以下为结果文件示例

3.7 CNV与SV的Circos图

            流程结果
            └── 07.Circos (进入文件目录)
                  ├── 图3.7.1_CNV_SV_circos_Sample1.png
                  └── ...   
          

图3.7.1 SV_CNV Circos图